单细胞悬液制备方法汇总
针对不同的样本类型，如何制备高质量的单细胞悬液是我们大家比较关注的问题，今天给大家详细的介绍一下从多种样本中制备单细胞悬液的方法，希望对大家有用。
单细胞悬液制备方法汇总
对我们科研人员来说，细胞是实验中必不可少的部分，根据自身实验需要，我们需要从各种样本中制备单细胞悬液，例如血液中的细胞；源于组织样本中的细胞；源于贴壁细胞，比如单核诱导贴壁后形成的巨噬细胞、树突状细胞等；源于悬浮细胞等。针对不同的样本类型，如何制备高质量的单细胞悬液是我们大家比较关注的问题，今天给大家详细的介绍一下从多种样本中制备单细胞悬液的方法，希望对大家有用。
一、外周血样本
（图片来源网络）
人外周血单个核细胞（Peripheralblood mononuclear cells ，PBMCs ）的分离制备：
1）医院及其血液中心采取的新鲜的肝素抗凝的2ml外周静脉血备用；
2）将肝素抗凝的静脉血用等体积的PBS稀释并充分混匀；
3）将人淋巴细胞分离液ficoll从 4 °C 取出，恢复至室温，取4ml转移至15ml 试管中备用；
4）用无菌吸管吸取稀释后的静脉血，沿管壁缓慢入至人淋巴细胞分离液液面上（ficoll分离液：抗凝血1:1），缓缓地不要晃荡，保持界面的清楚；
5）将加完外周静脉血后的 50 ml 试管放入台式离心机中，2200 rpm 水平离心，室温 25 min，注意离心机升降速都调至最慢，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1成的制动。
6）离心完毕后，小心取出15 ml 试管，离心后管内可分为三层，在上、中层界面处有一层以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，即为我们所需要的单个核细胞；
7）用无菌吸管吸取白色云雾层狭窄带的单个核细胞，并置于另一 15 ml 离心管中，加入5mlPBS，1500 rpm，室温离心 5min，并充分洗涤细胞两次；
8）末次离心后，弃去上清，加入完全 RPMI 1640 培养液重悬细胞，充分混匀；
9）用白细胞计数液计数单个核细胞，根据实验所需，加入完全 1640培养液调整细胞浓度到所需要的浓度。
二、组织样本
（图片来源网络）
常见的组织类型：小鼠脾脏、肝脏、心脏、肺脏、脑组织、肿瘤组织、人肿瘤组织、皮肤组织……
传统组织处理方法：
机械法：网搓法、研磨法
适用样本类型：脾脏、淋巴结、胸腺
网搓法
1、将300 目尼龙网扎在无菌的小烧杯上；
2、把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；
3、收集细胞悬液于离心管中， 1500rpm离心5min；
4、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。
研磨法
1、先将组织剪成1-2mm大小组织块；
2、放入组织研磨器中，转动研棒，研至匀浆；
3、加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；
4、收获细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，1500rpm离心5min；
5、弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。
酶解法：胰蛋白酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋白酶
适用样本类型：肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脊髓、脑、肠道、皮肤、肿瘤等；
操作步骤：
1、先将组织剪成泥状。
2 、用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用千消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酌工作浓度一般为 0. 1 %—0 . 5 % 。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0 . 25 %胶原酶，胶原酌对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用浓度为 0 . 1—0 . 3ug / ml ，用大于组织量30—50 倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在 37°C ，摇床上消化组织，消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶油作用 20—60 min，胶原酶需1—4h左右，一般还会加入DNA核酸内切酶。
3、消化完毕后，将细胞悬液通过200目孔径尼龙网过滤，以除掉未充分消化的组织；
4、已过滤的细胞悬液经1500rpm离心5min后，弃上清液，加红细胞裂解液重悬沉淀，室温作用5min，加等体积的PBS中和后，1500rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次，再用PBS重悬，细胞计数后即可使用。
下表整理了人和小鼠常见的不同组织处理方法，并附上参考文献，此内容来源于Worthington：
Species | Cells | Enzyme(s) | Reference |
Human | 脂肪细胞 | 2型胶原酶:0.01-0.5% | Effect of Collagenase Concentration on The Isolation of Small Adipocytes from Human Buccal Fat Pad., J Oral Sci , 2018 |
Human | 脂肪细胞 | Collagenase Type 1: 0.1% | Epigenome-wide Association Study of Body Mass Index, and the Adverse Outcomes of Adiposity, Nature541, 81, 2017 |
Human | 基质细胞 | 胶原酶2型:0.075% | Ultrasound-Assisted Liposuction Provides a Source for Functional Adipose-Derived Stromal Cells., Cytotherapy 19, 1491-1500, 2017 |
Human | 骨髓基质细胞
| 胶原酶1型:0.075% | Mesenchymal Stromal Cells Protect Human Cardiomyocytes from Amyloid Fibril Damage, Cytotherapy 19, 1426-1437, 2017 |
Human | 间充质干细胞 | 胶原酶2型:0.2% | Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Alters Their Immunomodulatory Properties in a Tissue-Specific Manner., Stem Cells 35, 1636-1646, 2017 |
Human | 脂肪源内皮细胞 | 胶原酶1型:0.1% | Autologous Cell Sources in Therapeutic Vasculogenesis: In Vitro and In Vivo Comparison of Endothelial Colony-Forming Cells from Peripheral Blood and Endothelial Cells Isolated from Adipose Tissue., Cytotherapy 18, 242-52, 2016 |
Human | 脂肪干细胞 | 胶原酶1型:0.1% | High Glucose-Induced Reactive Oxygen Species Generation Promotes Stemness in Human Adipose-Derived Stem Cells,Cytotherapy 18, 371-83, 2016 |
Human | 骨髓基质细胞
| 胶原酶4型:0.2% | Effect of Mild Heat Stress on the Proliferative and Differentiative Ability of Human Mesenchymal Stromal Cells., Cytotherapy17, 359-68, 2015 |
Human | 脂肪干细胞
| 胶原酶2型:0.1% | Expression Analysis of Human Adipose-Derived Stem Cells During In Vitro Differentiation to an Adipocyte Lineage., BMC Med Genomics 8, 41, 2015 |
Human | 脂肪基质
| 胶原酶1型:0.075% | Therapeutic Potential of Adipose-Derived SSEA-3-Positive Muse Cells for Treating Diabetic Skin Ulcers.,Stem Cells Transl Med 4, 146, 2015 |
Human | 脂肪组织细胞
| 胶原酶1型:0.1% | Differential Effects of Processing Time and Duration of Collagenase Digestion on Human and Murine Fat Grafts.,Plast Reconstr Surg 136, 189e-199e, 2015 |
Human | 脂肪基质血管细胞 | 中性蛋白酶:2.4 u/ml 胶原酶:250 u /毫升 | Human White and Brite Adipogenesis is Supported by MSCA1 and is impaired by Immune Cells., Stem Cells 33, 1277-91, 2015 |
Human | 脂肪源性间充质干细胞 | 胶原酶2型:0.1% | Defined Serum-Free Media for In Vitro Expansion of Adipose-DerivedMesenchymal Stem Cells., Cytotherapy 16, 915, 2014 |
Human | 脂肪提取干细胞 | 胶原酶1型:0.15% | Choosing the Right Type of Serum for Different Applications of Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Influence on Proliferation and Differentiation Abilities.,Cytotherapy 16, 789, 2014 |
Human | 间充质基质 | 胶原酶1型:0.1% | Proliferative and Phenotypical Characteristics of Human Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Comparison of Ficoll Gradient Centrifugation and Red Blood Cell Lysis Buffer Treatment Purification Methods., Cytotherapy 16, 1220-8, 2014 |
Human | 脂肪间质干细胞 | 动物游离胶原酶:200u /ml | Xenofree Enzymatic Products for the Isolation of Human Adipose-Derived Stromal/Stem Cells., Tiss Eng 19, 473-8, 2013 |
Human | 基质血管成分 | 胶原酶1型:0.075% | Stromal Vascular Fraction Isolated from Lipo-Aspirates Using an Automated Processing System: Bench and Bed Analysis., J Tissue Eng Regen Med 7, 864, 2013 |
Human | 脂肪干细胞 | 胶原酶1型:0.1% | Platelet-Rich Plasma Greatly Potentiates Insulin-Induced Adipogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells Through a Serine/Threonine Kinase Akt-dependent Mechanism and Promotes Clinical Fat Graft Maintenance., Stem Cells Transl Med 1, 206-20, 2012 |
Human | 血管周围干细胞 | 胶原酶2型:0.1% | An Abundant Perivascular Source of Stem Cells for Bone Tissue Engineering., Stem Cells Transl Med 1, 673, 2012 |
Human | 脂肪来源的间质血管 | 胶原酶1型:0.1% | Concise Review: Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells and Platelet-Rich Plasma: Basic and Clinical Implications for TissueEngineering Therapies in Regenerative Surgery., Stem Cells Transl Med 1, 230-6, 2012 |
Mouse | 脂肪基质 | 胶原酶1型:0.1% | Adipose Stromal Vascular Fraction-Mediated Improvements at Late-Stage Disease in a Murine Model of Multiple Sclerosis., Stem Cells 35, 532-544, 2017 |
Mouse | 脂肪间质细胞 | 胶原酶2型:0.2% | Adipose Mesenchymal Stromal Cells Minimize and Repair Radiation-Induced Oral Mucositis.,Cytotherapy 18, 1129-45, 2016 |
Mouse | 脂肪基质
| 胶原酶1型:0.1% | Improved Mobilization of Exogenous Mesenchymal Stem Cells to Bone for Fracture Healing and Sex Difference., Stem Cells 34, 2587-2600, 2016 |
Mouse | 脂肪细胞 | 胶原酶:0.1% | The Effects of A Single Developmentally-Entrained Pulse of Testosterone in Female Neonatal Mice On Reproductive and Metabolic Functions in Adult Life., Endocrinology 156, 3737, 2015 |
Mouse | 间质血管细胞 | 胶原酶2型:0.2% | Natural Killer T Cells in Adipose Tissue are Activated in Lean Mice., Exp Anim 62, 319, 2013 |
Mouse | 脂肪干细胞 | 胶原酶2型:0.1% | Biological and Clinical Availability of Adipose-Derived Stem Cells for Pelvic Dead Space Repair., Stem Cells Transl Med 1, 803, 2012 |
三、贴壁细胞
（图片来源网络）
贴壁细胞（adherent cells）:活体体内细胞当离体置于体外培养时大多数以贴壁方式生长，主要包括正常细胞（例如：成纤维细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞、心肌细胞以及肝、肺、肾、乳腺、皮肤细胞等）和肿瘤细胞。
胰蛋白酶消化
胰蛋白酶：最常用，浓度一般0.25%-5%，37℃消化时间一般1-5min，用血清终止；
四、脱落细胞
（图片来源网络）
临床上常见的脱落细胞经过简单处理就能制备成单细胞悬液，用于后续实验，具体操作：
1、食管拉网细胞的单细胞悬液的制备：
（1）将食管拉网器上的细胞洗脱到10ml PBS液中， 1500rpm，5min离心后，再用PBS液洗2次，800rpm，离心2min，弃上清；
（2）再加入PBS液5ml，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（3）加少许PBS液混匀沉淀细胞，备用。
2、胸、腹水脱落细胞的制备
（1）抽取胸、腹水50ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；
（2）将底部10~20ml用长吸管移入试管中，用PBS液洗3次，以1500r/min离心沉淀5min；
（3）再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（4）加少许PBS液，混匀；加固定液或低温保存，备用。
3、冲洗液细胞样品的制备
（1）用300~500ml生理盐水冲洗膀胱，冲洗一定时间后，吸出冲洗液放入容器中于冰箱内置6~12h；
（2）取沉淀液20~40ml，离心沉淀并以生理盐水洗2次，吸上清；
（3）加10ml PBS液，混匀，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
（4）过滤后1000rpm/min，10min，离心沉淀，去上清；加固定液或低温保存备用。
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